MICROBIOLOGY                     

محیطهای مغذی: مانند آگار خوندار کلنیهای سالمونلا اغلب بزرگ به قطر2 تا 3 میلیمتر به رنگ خاکستری باسطح محدب ومرطوب پس از 24ساعت در دمای37درجه سانتیگراد دیده می شود .

محیطهای انتخابی : مانند محیطهای کشت بریلیانت گرین, بیسموت سولفیت ,HEA - SS این محیطها مانع رشد کلی فرمها می گردد وسالمونلاهادر این محیط ها رشد می کنند

XLD :

محیطهای انتخابی وافتراقی : مانند محیطهای مک کانکی, محیطEMB وDCA(دزوکسی کولات سیترات) کلنیهایی که روی این محیطها نمایان می شوند به علت عدم تخمیر لاکتوز بی رنگند

محیطهای غنی کننده : مانند محیط سلنیتF , محیط مایعGN این محیطها از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری به عمل آورده و سرعت تکثیر سالمونلا و شیگلا دراین محیطها افزایش پیدا می کند

الف) کشت مدفوع :

روش کار :نمونه مشکوک رابروی محیط مک کانکی یا EMB وSS وهمچنین بروی محیطهای غنی کننده مانند سلنیتF یاGN بریلیانت گرین - بیسموت سولفیت آگار کشت داده و دردمای 37درجه سانتیگراد به مدت 24ساعت نگهداری کنید .در روزبعد ازمحیطهای سلنیتFیاGN

نیز بر روی محیطهای کشت مناسب رپیلیکاز داده می شود .از کلنیهای مشکوک (بی رنگ)وSH2دار می توان جهت تستهای بیوشیمیایی استفاده کرد .

 

برای تشخیص باید از کلنیهای سالمونلا بر روی محیطهای کلیگر کشت داد که پس از 24ساعت به صورت آلکالن-اسید(تخمیر لاکتوز منفی وتخمیر گلوکز مثبت)ظاهر می شود

تمام سالمونلاها بجز پاراتیفی Aدرمحیط کلیگر ایجاد SH2 وتست اوره درسالمونلا منفی است وتست IMVIC درمورد سالمونلا تیفی و پاراتیفی Aبه صورت از چب به راست --+- ودر سالمونلا پاراتیفی B وC وتافی موریوم به صورت +-+- است .

نکته: سالمونلاتیفی در صورت مزمن شدن معمولا درکیسه صفرا کولونیزه شده وتکثیر پیدا می کند  واز طریق مدفوع دفع میشود لذا در موارد مزمن می توان سالمونلا راازکشت مدفوع جدا کرد

برای حصول نتیجه بهتر باید هنگام آزمایش از مسهل نمکی استفاده کرد تا کیسه صفرا تخلیه گردد

نکته : درموارد مشکوک به تب تیفوئیدی ازخون بیمارجهت انجام کشت نمونه گرفته می شود ودرعفونتهای گاستروآنتریت نمونه مدفوع جهت کشت استفاده می شود

روش انجام تست : برای انجام تست سرولوزیک باید ازباکتری موردآزمایش شیرابه یکنواختی در سرم فیزیولوزی  تهیه کرد وسپس یک قطره از آنرا با یک قطره آنتی سرم o(آنتی زن سوماتیک) روی لام شیشهای مخلوط نمود بروز آگلوتیناسیون قابل مشاهده با چشم غیر مسلح پس از یک تا دودقیقه تست مثبت رانشان می دهد .

نکته : اگر باکتری با هیچ یک از آنتی سرمهای oآگلوتیناسیون ندهد دلیل بروجود آنتی زن کپسولی یا آنتی زنVi ذرسالمونلا تیفی -سالمونلا آنتریدیس وپاراتیفی cاست که روی آنتی زن سوماتیک را پو شانده است

ب) کشت خون :

برای کشت خون در حدود10میلی لیتر ازخون بیمار رادرهنگام تب گرفته ودر محیطtrypticase  soy Brothتلقیح کرده برای مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری نمایید وسپس به محیط کشت جامد منتقل کنید و توسط تستهای بیوشیمیایی کلنی مشکوک را بررسی کنید . در موارد تب تیفوئیدی در90 درصد ازموارد کشت خون درهفته اول بیماری مثبت است

ج)کشت ادرار :

برای کشت ادرار باید ادرار رادر دور 2500تا3000 به مدت 20 تا 30 دقیقه سانتریفوز کنید و سپس مایع روی را دور ریخته و به وسیله آنس از رسوب ته لوله نمونه برداری کنید . در سطح پلیتهای حاوی محیط کشت جامد ودرمحیط سلنیتfکشت داده و همچنین تستهای بیوشیمیایی را نیز انجام داد

نکته : تولید SH2 در سالمونلا تیفی به شکل حلقه یالکه سیاهرنگ درحدفاصل  قسمت شیبدار وبخش استوانه محیط کلیگرآیرون آگار دیده می شود .

نکته : سالمونلا تیفی برروی محیط بیسموت سولفیت آگار (ویلسون-بلر) کلنیهای سیاه با جلای فلزی ایجاد می کند .

نکته : برای افتراق سالمونلا از سیتروباکتر از تست لیزین استفاده می شود (سالمونلا LDC+وLDA - می باشد)

 

 

 

اشكال محيط كشت :

اشكال محيط كشت :

1 - لوله كشت مايعBroth tubes : لوله هاي شامل محيطهاي مايع مي باشد نوترين از قبيل تريبتي كيس سوي براث شامل سوبسترا براي رشد ميكروب از قبيل بانكراس - كلريد سد يم كه بس از تلقيح به 3 فرم ديده مي شود :

1- غشا نازكPellicle شامل يك توده اركانيسم شناور دربالاي محيط كشت(see Fig. 7A)

2- مه ألوديTurbidity اركانيسم همانند ابردر محيط ديده مي شود(see Fig. 7B)

3 - رسوبSediment توده اركانيسم ته نشين طاهر مي شود(see Fig. 7C).

2- لوله خوابيده(see Fig. 8A) و (see Fig. 8B)

3 -  Stab tubes (see Fig. 9)

4 - بليت أ كارAgar plates كلني هاي مختلف را مي توان بااستفاده از مدل فوق شرح دادAppendix A

محیط آگارخوندار :

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیطهای کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتریها راتامین می کندوهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط تادرجه چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید

هموليز Bاستافيلوكوك اوروس

 

 

 

محیط شکلاتی:

محیط کشت آگار شکلاتی که درآن گلبولهای قرمز به صورت لیز وجوددارد ازمحیطهای کشت مغذی است که رشداغلب باکتریها راتامین میکند. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگارپایه گه همان پایه آگارخوندار است کافی است که خون دردرجه حرارت هشتاد درجه سانتیگراد به محیط اضافه شود

محیط مولر هینتون :

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطرواتوکلاونمودن محیط رادرپلیت های استریل تقسیم نمایید

محیط EMB :

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتری های گرم منفی بسیار مناسب است. کلنی کلی باسیل برروی این محیط به صورت جلای فلزی یا درخشندگی متالیک ظاهر میگردند

محیط مک کانکی آگار :

در این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می شودوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتریهای گرم منفی مناسب است. کلنی ها  بر حسب استفاده باکتری ازلاکتوز بصورت لاکتوزمثبت(صورتی)ولاکتوز منفی(بی رنگ)ظاهر می شوند

MAC  محيط انتخابي وافتراقي است :

ارگانيسم هاي گرم منفي رشد كرده وگرم مثبت هارشد نمي كنند كه به علت وجود بايل نمك و كريستال ويوله است

محیط  :SS

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت وبسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلاوشیگلابخصوص ازنمونه مدفوع بسیار مناسب است

محیط بایل اسکولین آگار :

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرابرای شناسایی آنتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرابه برخی از استرپتوکوکها ازجمله آنتروکوک اجازه رشد میدهدوباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شودودر صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکزواسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجادکمپلکس سیاه رنگ می شود

محیط لیزین آیرون آگار :

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دامیناسیون لیزین استفاده میشود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود

محیط مانیتول سالت آگار :

در این محیط به علت حضور 7.5% نمک از رشد بسیاری از باکتریها جلوگیری شده ولی اساتفیلو کوکها به خوبی رشد می نماید . این محیط همچنین حاوی قند مانیتول و معرف فنول رد می باشد و در صورتی استافیلوکوک مورد نظر قادر به تخمیر مانیتول باشد باعث اسیدی شدن محیط و تغییر رنگ معرف به زرد می شود

محیط کلیگر آیرون آگار :

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود

محیط مالونات :

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در استفاده از مالونات سدیم به عنوان منبع کربن استفاده می شود . تغییر رنگ محیط از سبز به آبی نشانه مثبت بودن تست است

محیط SIM:

از این محیط برای بررسی حرکت باکتری توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 و تست اندول استفاده می شود.

 

باکتریهای هوازی :

باکتریهایی هستند که درفقدان مولکول اکسیزن قادربه رشد نمی باشند. این باکتریها به راحتی درهوای اتاق رشد می نمایند وانکوباتورهای معمولی به راحتی رشد آنهاراتامین میکنند

باکتریهای بی هوازی اجباری :

باکتریهای هستند که فقط درشرایط فاقدمولکول اکسیزن قادر به رشدمیباشند. بسته به میزان حساسیت این گروه به اکسیزن می توان از روشهای متفاوت برای تامین شرایط موردنیاز رشد آنهااستفاده کرد.

ازجمله روشهای معمول انکوباتورهای بی هوازی هستند که هوای داخل انکوباتور بامخلوطی ازگازهای نیتروزن هیدروزن ودی اکسیدکربن جایگزن می گردد. همچنین می تواندازگازپک مخصوص بی هوازی جهت تولید شرایط عدم حضور اکسیزن استفاده کرد

 :GAS PACK

گاز پک توسط اسکات درآمریکا ساخته شده دراین سیستم ازیک جار بی رنگ پلاستیکی با یک درپوش محکم استفاده شده است. این گازپک هااغلب باعث تولید هیدروزن ودی اکسید کربن می شوند که هیدروزن درحضور کاتلیزورموجود در درب جار ترکیب شده وبه صورت قطرات آب درجداره ظرف ظاهرمی شود. همجنین دراین واکنش فشار داخل جار افت می کند که این دوعلامت منواند به عنوان نشانه ای ازعملکردخوب گاز پک مطرح باشد.

برای تایید قطعی وحتمی می توان از اندیکاتورهای شیمیایی نیزاستفاده کرد. امروزه دربین اندیکاتورهای شیمیایی متیلن بلو رایج ترین اندیکاتورمی باشد که درحضوراکسیزن به رنگ آبی ودرعدم حضوراکسیزن احیاشده و بیرنگ میگردد

روش کار :

برای انجام آزمایش پاکت را باز کرده ودرجار حاوی پلیتهای کشت داده شده قرار داده و10سی سی آب مقطر رابه داخل پاکت اضافه کنید. اندیکاتورراباز کرده ودرداخل جار قراردهید درب جار رامحکم بسته پس ازچندقیقه گرماداخل جارتولیدمی شود. این گرما بالمس کردن درب جارمشخص می شود. تولید قطرات آب در جداره جارنشانگر عملکرد خوب کاتالیزوروحذف اکسیزن است پس از مدت یک تادوساعت فعالیت کاتالیزور کم می شود

نکته: ابتدا اندیکاتوردرمجاورت اکسیزن به رنگ بنفش درخواهدآمد. درصورتی که جارفعال باشداندیکاتوربه مرور زمان بی رنگ خواهدشد

نکته: برای فعال کردن مجدد کاتالیزور کافی است آنرااتوکلاو نماییم یابر روی چراغ حرارت دهیم

نکته: درمحیط بایل اسکولین آگار علاوه بر اسکولین ومواد صفراوی سدیم آزید نیز برای جلوگیری ازرشدباکتریهای گرم منفی به کاررفته است ومعرف رنگی محیط سیترات فریک می باشد

تعیین تعداد باکتری:

روشهای متعددی وجود دارد که ازآنجمله می توان به روش شمارش کلنی وکدورت سنجی اشاره کرد .روش کدورت سنجی  ازسادهترین روشهای تعیین تعداد باکتری ها درسوسپانسیون باکتری است .برای سنجش کدورت سوسپانسیون می توان کدورت آن راتوسط دستگاه توربیدومتر اندازه گیری وباجداول مربوطه مقایسه وتعداد باکتری رااعلام نمود ویا کدورت سوسپانسیون را باکدورتهای استاندارد بطورماکروسکوپی توسط چشم مقایسه نمود

Mac Farland Nephelometery Standards لوله های مک فارلند را می توان با کمک مخلوط نمودن اسید سولفوریک 1 درصد وکلرید باریم 1 درصد (یک گرم در 100 سی سی آ ب مقطر) براساس جدول زیر تهیه نمود